После получения ооцитов (яйцеклеток) в результате пункции яичников и аспирации содержимого фолликулов, чашку с ооцитами помещают в инкубаторы для культивирования. Цель культивирования in vitro - культивирование гамет и эмбрионов в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo.
Для обеспечения соответствующей питательной среды используются специальные коммерческие культуральные среды. Среды содержат определенные концентрации компонентов, которые оказались основными для развития человеческого эмбриона, а именно, глюкозу, забуференные солевые растворы, синтетический заменитель сыворотки, пенициллин и другие.
Однако физиологическое pH (7,2 - 7,3) и температура (37 °С) поддерживаются в основном инкубаторами, в которых проводят культивирование. Культуральная среда содержит бикарбонатную буферную систему, использующую газообразный диоксид углерода для поддержания рН. Инкубаторы устанавливают и калибруют соответствующим образом, чтобы обеспечить точную концентрацию CO2 и температурные условия.
Установлено, что пониженная концентрация О2 в камере инкубатора оказывает положительное влияние на развитие эмбрионов, особенно на поздних этапах культивирования (4-6 день). Снижение концентрации кислорода внутри камеры достигается подачей газообразного N2. Поэтому для культивирования эмбрионов в медицинском центре Интерсоно Медикавер Групп используют инкубаторы, имеющие опцию подачи азота и контроля уровня О2 внутри камеры.
Ежедневно эмбриологи мониторят температуру и концентрацию газов внутри инкубатора, а также наблюдают за развитием эмбрионов и вносят данные в Протокол культивирования.
Нормальным темпам развития эмбриона отвечает:
2 день культивирования – стадия 2-4 бластомеров;
3 день культивирования – стадия 6-8 бластомеров;
4 день культивирования – стадия 10-12 бластомеров, компактизации или морулы;
5 день культивирования – стадия морулы или бластоцисты;
6 день культивирования – бластоциста.
Оценку ранних эмбрионов (2-3 день культивирования) проводят по двум показателям - количеству клеток (эластомеров) и их качеству.
Категории качества ранних эмбрионов:
А - эмбрионы не содержат фрагментации (фрагментация - небольшие участки цитоплазмы, которые не содержат генетического материала), симметричные бластомеры;
В - эмбрионы содержат незначительное фрагментацию (до 25%), большинство эластомеров симметричные;
С - у эмбрионов выраженная фрагментация > 25%, бластомеры асимметричные;
D - фрагментация эмбрионов составляет более 50%, бластомеры асимметричны.
На 5-6 день культивирования эмбрион достигает стадии бластоцисты. Оценку бластоцисты проводят по трем показателям - степень зрелости бластоцисты, качество внутриклеточной массы (ВКМ), из которой будет формироваться сам эмбрион и качество трофектодермы (ТЕ), из которой будут формироваться плодные оболочки.
Степени зрелости бластоцист:
І - ранняя бластоциста. Бластоцель менее половины объема эмбриона;
II - полная бластоциста. Бластоцель полностью занимает объем эмбриона;
III – разросшаяся бластоциста (експандированная). Бластоцель становится больше и начинает истончаться зона пеллюцида;
IV - трофектодерма начинает проникать через зону пеллюцида (хетчинг)
V – вылупившаяся бластоциста покинула зону пеллюцида.
Качество ВКМ оценивается как:
А - плотная, с большим количеством клеток;
В – свободное группирование среднего количества клеток;
С - незначительное количество клеток.
Качество ТЕ оценивается как:
А - много клеток, которые формируют трофектодермальный слой;
В - немного клеток;
С - незначительное количество крупных клеток.
Качество перенесенных эмбрионов коррелирует с наступлением беременности. В частности, чем быстрее темпы дробления, тем выше шансы имплантации таких эмбрионов. Но речь идет только о вероятности имплантации. То есть имплантироваться может как эмбрион хорошего качества, так и эмбрион «плохого» качества. Однако шансы имплантироваться у эмбрионов хорошего качества значительно выше. Также стоит помнить, что, оценивая качество эмбриона, мы говорим только о его темпах развития и морфологию (внешний вид), а не о генетическом статусе эмбриона.
